7/1/09

Inclusión de Muestras Biológicas

Víctor Hugo Tomasi



Maniobras para Obtener Cortes Histológicos


Inclusión de la muestra: diferentes sustancias han sido propuestas como masa de inclusión para obtener un bloque final que permita el seccionamiento con micrótomo. De las más empleadas en histotecnología, algunas se utilizan en medios acuosos y pueden difundir en el tejido hidratado, mientras que otras, las cuales son compuestos hidrofóbicos, precisan la eliminación previa del agua presente en las muestras mediante el uso de agentes deshidratantes adecuados.








Medios Hidrofílicos: la Gelatina se emplea en distintas propuestas histológicas, por ejemplo para la realización de cortes de órganos huecos enteros, empleando un micrótomo de fuerza tipo Tëtrander (corazón, ojo), o como alternativa sencilla cuando se requieren cortes por congelación (García del Moral 1993). Asimismo, la gelatina puede utilizarse en estudios enzimo e inmunohistoquímicos aplicados en muestras duras, ya que este medio de inclusión presenta un punto de fusión bajo y la infiltración de la muestra se puede realizar a temperaturas por debajo de 40º C, lo cual preserva todo compuesto tisular termolábil. Todas las soluciones de gelatina deben estar adicionadas con unas gotas de ácido fénico al 0.1% para evitar la proliferación de microorganismos. Las muestras fijadas con formol sólo o con mezclas formólicas deben lavarse muy bien antes de impregnarlas con gelatina, ya que justamente el formol es quien provocará el endurecimiento ulterior del bloque de inclusión para el seccionamiento con micrótomo.



Técnica de Inclusión:

- Lavar la muestra con agua común a chorro continuo durante 12 hs.
- Impregnar con gelatina al 10% a 37º C durante 24 hs.
- Colocar las muestras en gelatina al 20% a 37º C durante 24 hs.
- Incluir en molde adecuado con gelatina al 20% y dejar enfriar a 4º C. Durante 2 horas.
- Tallar con una espátula caliente y endurecer el bloque con Formol-Calcio al 10% durante 24 horas.
- Realizar los cortes.




La Carboxirresina (carbowax) es un compuesto derivado del polietilenglicol (PEG), polímero de peso molecular variable, hidrosoluble y cuya fórmula general es: HO-CH2–(CH2-O-CH2)n–CH2-OH. Los polímeros de peso molecular menor que 1000 son líquidos a temperatura ambiente pero a medida que aumenta el peso molecular del polímero estos compuestos se vuelven más viscosos. De esta manera, los PEG de peso molecular superior a 1200 son compuestos sólidos temperatura ambiente, aptos para la inclusión de muestras biológicas de pequeño tamaño.

El monoestearato de polietilenglicol es la carboxirresina más empleada en técnica histológica por tratarse de una sustancia químicamente activa y capaz de desencadenar fuerzas intermoleculares que aseguran la obtención de un bloque de inclusión firme para la realización de cortes histológicos. Durante la inclusión se utiliza primero un PEG de bajo peso molecular para permitir la rápida infiltración del espécimen y luego, en un segundo paso, el uso de otro PEG de mayor peso molecular. La preparación de estos baños con PEG debe realizarse en ambientes sumamente secos debido a que presentan una elevada higroscopía. Al igual que la gelatina, el empleo del PEG permite el estudio de enzimas y antígenos tisulares, ya que la polimerización de esta sustancia toma lugar a temperaturas por debajo de los 50ºC.

Técnica de Inclusión:

- Fijar con formol al 4% en PBS a 4ºC durante 12 horas.
- Lavar con PBS durante 30 minutos.
- Sumergir en: PEG 1000 al 50% en PBS a 45ºC durante 1 hora.

PEG 1000 al 80% en PBS a 45ºC durante 1 hora.
PEG 1000 puro a 45ºC durante 1 hora.
PEG 1550 puro a 45ºC durante 1 hora.

- Incluir PEG puro contenido en un molde adecuado y dejar sobre la mesada.
- Solidificar, montar sobre un taco de madera y guardar en heladera dentro de un recipiente bien tapado, en el que se agregó sílica-gel o cloruro de calcio para evitar humedad.



El seccionamiento con micrótomo común se debe realizar en ambiente seco. Los cortes histológicos obtenidos se deben montar sobre portaobjetos tratados previamente con una solución de goma adhesiva al 5% en éter petróleo. Se realiza una tira de cortes (3 ó 4) y se los estira sobre la superficie de Acetato de etilo contenido en una cápsula de Petri. Luego, se sumerge el portaobjetos en la cápsula y se retiran los cortes rápidamente, con la ayuda de un pincel. Se deja evaporar el acetato y antes de colorear o inmunomarcar, se debe lavar las secciones histológicas con 2 ó 3 baños de agua destilada o PBS, respectivamente.

El OCT es un medio sintético que favorece la realización de cortes en Crióstato a temperaturas muy bajas (-20ºC). Esta característica permite la inclusión de la biopsia sin fijación previa, ya que a esa temperatura se detienen los procesos posmortem del espécimen y la hace apta para estudios de lípidos, enzimo e inmunohistoquímicos. Una vez obtenidos los cortes y adheridos sobre portaobjeto, el cambio de temperatura (de -20º a temperatura ambiente) provoca la desecación de los tejidos, manteniendo a las enzimas proteolíticas inactivas. Sin embargo, antes de comenzar con las tinciones enzimo o inmunohistoquímicas es conveniente fijar los cortes histológicos con algún agente químico adecuado (acetona fría, vapores de formol, metanol), a fin de evitar que se reinicie la actividad proteolítica cuando se agreguen al tejido los reactivos “colorantes”, donde el solvente es un buffer y cuyas condiciones de incubación son similares a las fisiológicas. A menos que algún agente presente en la solución de tinción actúe simultáneamente como fijador químico (por ejemplo, en la coloración de lípidos).
El OCT es una mezcla comercial de alcohol polivinílico, polietilenglicol y excipientes (tipo Ames o similares) de composición reservada. Este medio de inclusión es viscoso a temperatura ambiente y muy similar a un adhesivo que se consigue en librerías, conocido como “boligoma®”. Si bien éste es más económico y adecuado para reemplazar al OCT, en mi experiencia he observado que los bloques de inclusión con OCT presentan mayor elasticidad, lo cual permite la obtención de cortes histológicos de mayor calidad y preservación del tejido, debido a la presencia de aquellos excipientes que actúan como crioprotectores.


En caso que las muestras ingresen al laboratorio fijadas con formol o, especialmente, con etanol, metanol o acetona, se recomienda infiltrar el tejido con alguna sustancia crioprotectora, tales como dimetilsulfóxido o sucrosa. El uso de crioprotectores asegura la formación de cristales de agua pequeños durante el enfriamiento, evitando áreas tisulares con desgarramiento.

Técnica de inclusión:

- Lavar la muestra en abundante agua común durante 30 minutos.
- Sumergir la muestra en:


Sucrosa al 10% a 4ºC durante 30 minutos.
Sucrosa al 20 % a 4ºC durante 30 minutos.

- Incluir en OCT contenido en un molde adecuado y colocarlo en Cámara a -20ºC.
- Realizar los cortes histológicos.




En patología muscular, tras realizar la inclusión, los bloques se sumergen rápidamente en isopentano (-50ºC) y luego se archivan en un tanque de nitrógeno líquido (-180ºC) hasta la realización de los cortes. Este procedimiento se realiza a fin de evitar desnaturalización y/o difusión de las enzimas, tales como Succino-deshidrogenasa, Citocromo-oxidasa, Esterasa, Fosforilasa, etc., que son objeto de estudio, por ejemplo en patología muscular.




Medios Hidrofóbicos: la Parafina es una sustancia de tipo céreo compuesta por mezclas de hidrocarburos saturados (alcanos) de peso molecular elevado, los cuales se obtienen durante la destilación fraccionada del petróleo. Las más empleadas en técnica histológica se pueden obtener en una amplia variación de su punto de fusión (40º - 70º C). A mayor peso molecular mayor será el punto de fusión y, por tanto, el grado de dureza del bloque de parafina a temperatura amiente. Esta característica se debe tener en cuenta en el momento de elegir la parafina y depende del tamaño y dureza de la muestra en estudio.
Si bien las parafinas presentan escasa reactividad química, las impurezas presentes en estos compuestos, que actúan como catalizadores y la permanente exposición a 60ºC en estufa de inclusión, hace que las parafinas utilizadas en nuestro laboratorio se vuelvan blandas (disminuye el peso molecular), debido a la ruptura que sufren los carbonos terminales de las cadenas hidrocarburadas, tal situación puede comprobarse por el color amarillento que adquieren (Tomasi & Morales 1996). Por este motivo, las parafinas clásicas fueron reemplazadas por diversas mezclas de polímeros plásticos de peso molecular controlado y otros aditivos que mejoran las características de las parafinas como medio de inclusión:

1. Viscosidad y poder de difusión a través del tejido.
2. Dureza homogénea en todo el bloque de inclusión.
3. Obtención de cortes histológicos uniformes y seriados.


En la rutina histológica se utilizan dos tipos de parafinas: Parafina Blanda, cuyo punto de fusión se encuentra entre los 42º y 46º C, se emplea durante la pre-impregnación con el propósito que los tejidos comiencen a infiltrarse rápidamente con esta parafina, debido a que tiene menor viscosidad. Posteriormente, las muestras se sumergen en un baño de Parafina Dura (punto de fusión: 56º - 58º C), cuyo grado de dureza en mayor y facilita el seccionamiento con micrótomo.

Técnica de inclusión:

- Fijar los fragmentos de tejido con un agente adecuado.
- Lavar las muestras según el fijador utilizado.
- Deshidratar en una serie de alcohol etílico en graduación creciente durante 1 hora en cada baño. Se puede duplicar cada baño, dependiendo de la cantidad y tamaño de las muestras a procesar (80º - 90º - 96º - 100º).

- Desalcoholizar con una agente intermediario durante 1 hora en cada baño (Etanol 100º/xilol (1:1) – Xilol, 2 cambios).

- Impregnar con parafina en estufa de Inclusión a 60ºC:

Xilol/parafina blanda durante 1 hora
Parafina blanda durante 1 hora
Parafina dura durante 2 horas como mínimo.

- Incluir en un molde adecuado: después que los especímenes permanecieron el tiempo indicado en parafina a fin que se impregnen correctamente, se realiza la Inclusión propiamente dicha, lo cual consiste en hacer un bloque de parafina dura con el material en estudios incluido en su interior. Para ello, se utilizan diferentes utensilios tales como “raviolera”, cajitas confeccionadas con papel parafinado o con moldes exclusivos para cassettes. Durante la inclusión en el molde se debe recordar que la cara del espécimen que se desea observar al microscopio debe tomar contacto con el fondo de dicho molde.


Montaje del bloque: tras incluir la muestra en estudio, se deja solidificar la parafina sobre una cubeta de hielo o en heladera a fin de que el bloque presente una dureza homogénea. Dependiendo del micrótomo puede que sea necesario montar el bloque sobre un taco de madera con el propósito de fijarlo adecuadamente en el porta-tacos de dicho micrótomo. Para ello, el bloque de parafina y con la ayuda de una espátula caliente, se adhiere al taco de madera asegurándonos que la superficie de corte mire ahora hacia arriba. Posteriormente, tallamos el bloque de parafina con la espátula hasta lograr una pirámide truncada:

Esta técnica de inclusión se puede realizar manualmente o con Procesadores Automáticos, los cuales presentan múltiples vasos para realizar los baños y un sistema mecánico de transporte controlado por un programador de horarios. Estos sistemas posen tres ventajas fundamentales (García del Moral 1993):

1. Permiten procesar simultáneamente gran cantidad de muestras diferentes.
2. Economizan notablemente la cantidad de reactivos empleados en el proceso
3. Realizan un rápido procesamiento a lo largo de la tarde-noche del día de recepción de las muestras, las cuales están dispuestas para ser incluidas y seccionadas con micrótomo en la siguiente jornada de trabajo.

A fin de obtener buenos resultados de procesamiento con estos sistemas es importante renovar los líquidos contenidos en los vasos cuando observamos enturbamiento u opalescencia en el segundo xilol o la percepción de olor a xilol en el último baño de parafina.


La Celoidina: es una sustancia amorfa, blanco-amarillenta, insoluble en agua y miscible en etanol-éter o benzoato de metilo. Químicamente es una mezcla de di- tri- y tetranitrato de celulosa, conocida como Colodión Elástico.




Seccionamiento de la muestra: para la realización de los cortes histológicos de espesor micrométrico, en tanto, lo suficientemente delgados como para permitir su observación microscópica, se utilizan aparatos llamados “micrótomos”. Existen seis tipos básicos de micrótomos: de Rotación, Deslizamiento, Congelación, Crióstato, Vibrátomo y Ultramicrótomo. Cada uno se diferencia del otro, no sólo por el uso para lo que fue diseñado, sino también por el tipo y distribución de sus partes constitutivas.





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